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生物素-親合素系統-生物素-親合素系統

時間:2022-04-28 18:40瀏覽次數:128
生物素-親和素系統(Biotin-Avidin—System,BAS)是70年代末發展起來的一種新型生物反應放大系統。
隨着各種生物素衍生物的問世,BAS很快被廣泛應用於醫學各領域。
近年大量研究證實,生物素—親和素系統幾乎可與目前研究成功的各種標記物結合。
生物素與親和素之間高親合力的牢固結合以及多級放大效應,使BAS免疫標記和有關示蹤分析更加靈敏。
它已成爲目前廣泛用於微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究的新技術。

原理

biotin生物素(biotin,B)廣泛分佈於動、植物組織中,常從含量較高的卵黃和肝組織中提取,分子量244.31Da.生物素分子有兩個環狀結構(如圖),其中Ⅰ環爲咪唑酮環,是與親和素結合的主要部位;II環爲噻吩環,C2上有一戊酸側鏈,其末端羧基是結合抗體和其他生物大分子的唯一結構,經化學修飾後,生物素可成爲帶有多種活性基團的衍生物——活化生物素。
活化生物素可以在蛋白質交聯劑的介導下,與已知的幾乎所有生物大分子偶聯,包括蛋白質,核酸,多糖,脂類等。
親和素(avidin,AV)亦稱抗生物素蛋白、卵白素,是從卵白蛋白中提取的一種由4個相同亞基組成的鹼性糖蛋白,分子量爲68kD,等電點pI=10.5;耐熱並耐受多種蛋白水解酶的作用.尤其是與生物素結合後,穩定性更好。
生物素與親和素間的作用是目前已知強度最高的非共價作用,親和常數(K)爲10mol/L,比抗原與抗體間的親和力(K=10.5~11L/mol)至少高1萬倍。
並且,二者的結合穩定性好專一性強,不受試劑濃度,PH環境,抑或蛋白變性劑等有機溶劑影響。
由於每個親和素能結合4個分子的生物素,這一特點可以用於構建一個多層次信號放大系統。
因此,BAS即可用於微量抗原、抗體及受體的定量、定性檢測及定位觀察研究,亦可製成親和介質用於上述各類反應體系中反應物的分離、純化。
親和素由於帶有一個糖鏈側鏈,導致容易和細胞表面的多糖發生非特異性親和。
因此,鏈黴親和素被開發出來。
鏈黴親和素(streptavidin,SA)是由鏈黴菌streptomyces avidinii分泌的一種蛋白質,分子量爲65kD。
鏈黴親和素分子由4條相同的肽鏈組成,其中每條肽鏈都能結合一個生物素,並且不帶任何糖基,因此與親和素一樣,一個鏈黴親和素分子也能結合4個生物素分子,二者親和常數(K)亦爲10mol/L。
鏈黴親和素的適用範圍比親和素更爲廣泛。

應用

生物素與診斷

生物素-親合素系統BAS-ELISA是在常規ELISA原理的基礎上,結合(B)與親和素(A)間的高度放大作用,而建立的一種檢測系統。
生物素很易與蛋白質(如抗體等)以共價鍵結合。
這樣,結合了酶的親和素分子與結合有特異性抗體的生物素分子產生反應,既起到了多級放大作用,又由於酶在遇到相應底物時的催化作用而呈色,達到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。
BAS用於檢測的基本方法可分爲三大類。
第一類是標記親和素連接生物化大分子反應體系,稱BA法,或標記親和素生物素法(LAB)。
第二類以親和素兩端分別連接生物素化大分子反應體系和標記生物素,稱爲橋聯親和素-生物素法(BRAB)。
第三類是將親和素與酶標生物素共溫形成親和素-生物素-過氧化物酶複合物,再與生物素化的抗抗體接觸時,將抗原-抗體反應體系與ABC標記體系連成一體,稱爲ABC法。
這一方法可以將微量抗原的信號放大成千上萬倍,以便於檢測。

生物素與親和層析

生物素-親合素系統親和層析是將具有特殊結構的親和分子製成固相吸附劑放置在層析柱中,當要被分離的蛋白混合液通過層析柱時,與吸附劑具有親和能力的蛋白質就會被吸附而滯留在層析柱中。
那些沒有親和力的蛋白質由於不被吸附,直接流出,從而與被分離的蛋白質分開,然後選用適當的洗脫液,改變結合條件將被結合的蛋白質洗脫下來。
生物素-親和素系統可以與親和層析的方法結合,大大提高純化蛋白質的純度,或者爲已知配體尋找受體。
步驟是首先將生物素共價結合到配體蛋白上,再將生物素化後的配體蛋白加入含有受體蛋白的混合物,然後將此混合物通過預先固定了親和素的層析柱,這時配體受體複合物就通過生物素-親和素系統停留在層析柱上,最後通過選擇性洗脫獲得此受體配體蛋白複合物或者僅有受體。
這一方法被廣泛運用於藥物研發行業,當人們發現某種藥物分子具有療效但是又不清楚它具體作用於哪種蛋白質時,可以將其生物素化然後把靶蛋白從成千上萬種蛋白質中“抓”出來。
生物素-親和素系統還可以用相似的方法分離DNA.方法是在DNA探針的一端掛上生物素,然後用其獲得目的DNA片段,再利用固定化的親和素回收這些DNA。

生物素與定位觀察

親和細胞化學是利用兩種物質之間的高度親和能力而相互結合的化學反應,廣義上說,抗原抗體相互作用也是一種物質間的相互親和。
先令生物素衍生物(如結合了生物素的凝集素)與細胞表面的糖鏈結合,然後再用被親和素標記的探針定位,這種方法更有利於微量抗原(或抗體)在細胞或亞細胞水平的定位。
此外,在轉染(blot technology)蛋白質,糖蛋白或者DNA過程中,使用生物素-親和素系統介導染色比傳統直接染色方法具有更高的靈敏度。

生物素與基因探針

傳統的基因探針是由帶放射性的磷酸鹼基合成的,我們可以用被生物素標記的磷酸鹼基合成基因探針,避免了實驗過程中放射性物質可能造成的傷害。
生物素-親合素系統

優勢

BAS在實際應用中所具有的巨大優越性,主要表現在以下幾個方面。

靈敏度

生物素容易與蛋白質和核酸類等生物大分子結合,形成的生物素衍生物,不僅保持了大分子物質的原有生物活性,而且比恬度高,具多價性。
此外,每個親和素分子有四個生物素結合部位,可同時以多價形式結合生物素化的大分子衍生物和標記物。
因此,BAS具有多級放大作用,使其在應用時可極大地提高檢測方法的靈敏度。

特異性

親和素與生物素間的結合具有極高的親和力,其反應呈高度專一性。
因此,BAS的多層次放大作用在提高靈敏度的同時,並不增加非特異性干擾。
而且,BAS結合特性不會因反應試劑的高度稀釋而受影響,使其在實際應用中可最大限度地降低反應試劑的非特異作用。

穩定性

親和素結合生物素的親和常數可爲抗原-抗體反應的百萬倍,二者結合形成複合物的解離常數很小,呈不可逆反應性;而且酸、鹼、變性劑、蛋白溶解酶以及有機溶劑均不影響其結合。
因此,BAS在實際應用中,產物的穩定性高,從而可降低操作誤差,提高測定的精確度。

普適性

生物素-親和素系統的多功能性還能提供一套統一的研究方法。
例如對於某待測分子,已經得到了對於該分子的生物素標記抗原,那麼配合結合親和素的膠體金可以在電鏡下觀測,配合結合熒光標記的親和素可以使用流式細胞儀篩選,配合連接到酶的親和素可以進行ELISA等免疫組化實驗。

其他

BAS可依據具體實驗方法要求製成多種通用性試劑(如生物素化第二抗體等)適用於不同的反應體系,而且都可高度稀釋,用量很少,實驗成本低;尤其是BAS與成本高昂的抗原特異性第一抗體偶聯使用,可使後者的用量大幅度減少,節約實驗費用.此外,由於生物素與親和素的結合具高速、高效的特性,儘管BAS的反應層次較多,但所需的溫育時間不長,實驗往往只需數小時即可完成
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